PRACTICA #9
Determinación de Coliformes por el NMP
Introducción:
Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos
presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo
por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados
en diluciones en serie, haciendo crecer
microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos,
como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias(UFC) o la
estimación por el método del Número Más Probable (NMP).
El método del número más
probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente
utilizado. Empleado para estimar el número de microorganismos en muestras
de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que
también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y
anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es
aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un
subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44º C en
vez de 37 ºC como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95%
del grupo de los Coliformes presentes en heces están
formados por Escherichia coli y
ciertas especies de Klebsiella.
Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de
los animales de sangre caliente.
Constituyen un grupo heterogéneo con hábitat
primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es
constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de
sobrevivencia y multiplicación fuera del intestino también se observan en aguas
potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminación
fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el número de coliformes en
agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente. Cuando
los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos adquiere un significado distinto al
que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un
tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos
microorganismos se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.
Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes
totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está
conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter
y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias
Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h
de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada,
sin embargo la más prominente es Escherichia coli. La demostración y el
recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de
medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y
diferenciales.
Asimismo, existe en nuestro país el grave problema de
contaminación de ríos, lagos acuíferos y costas debido a que estos son
utilizados como depósito de todos los desechos generados por las actividades
humanas.
Estos microorganismos pueden sobrevivir al tratamiento,
por lo que su reúso p.ej., en riego agrícola, actividades recreativas: Aguas de
piscinas, baños de hidromasaje, aguas potables naturales, actividades
piscícolas y aguas marinas superficiales (playas), representan un riesgo
potencial a la salud pública.
La presencia y extensión de contaminación fecal es un
factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las
heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los
mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la
salud pública al estar en contacto con el ser humano.
El examen de muestras de agua para determinar la
presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el
intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicación,
pues dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos
coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse para
estimar el grado de contaminación fecal.
Fundamento
El método de la NPM es un método robusto por lo que puede
aplicarse en cualquier tipo de agua, aún aquellos que contienen gran cantidad
de materia orgánica. Para la determinación del NMP de Coliformes Totales y
Fecales en este tipo de aguas, es necesario proceder a preparar diluciones
decimales de la muestra, debido a que se espera que la concentración de
coliformes sea superior en éstas que en un agua potable. El número de
diluciones varía mucho, dependiendo del origen de la muestra a tratar. Por lo
demás, para su análisis de procede en la misma forma que para una muestra de
agua potable.
Son Organismos coliformes aquellos capaces de crecimiento
aeróbico ya sea 35 ó 37 ± 1°C en un medio de cultivo líquido lactosado con
producción de acido y gas dentro de un periodo de 48 h
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza
es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los
microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean
capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono.
Durante la fase confirmativa se emplea como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo
permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las
sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más
probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos
positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las
bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una
temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h.
Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a
partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por
agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina
azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas
(IMViC) a las colonias típicas.
Objetivos:
Familiarizarse con los métodos de recuento,
especialmente con el de NMP.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o
alimentos mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales,
coliformes fecales y Escherichia coli.
Diferenciar los organismos coliformes totales de los
microorganismos coliformes fecales.
Material:
v Muestra de
agua.
v Mechero
Bunsen.
v Cerillos ó
encendedor.
v 9 tubos
estéril conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril.
v 9 Pipetas de
10 mL estériles.
v Bilis Verde
Brillante estéril.
v 2 Cajas de
Petri conteniendo Agar Endo estéril.
v Agitador de
tubos Vortex.
v Gradillas
para tubos.
v Autoclave
v
v Asa
Bacteriológica.
v Incubadora a
35 °C.
v Baño
Incubador para Coliformes fecales a una temperatura constante.
METODOLOGÍA
PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS Y SOLUCIONES.
Caldo lauril
triptosa (CLT). Triptosa
40.0g Lactosa 10.0g Cloruro de
sodio (NaCl) 10.0g Fosfato
monobásico de potasio (KH2PO4) 5.5g Fosfato
dibásico de potasio (K2HPO4) 5.5g Lauril
sulfato de sodio 0.2g Agua para
llevar a 1000 cm3 Caldo bilis
lactosa verde brillante: Peptona 10.0g Lactosa 10.0g Bilis de buey
(deshidratada) 20.0g Verde
brillante (1% m/m en solución acuosa) 13 cm3 Agua para
llevar a 1000 cm3
*Nota: Como medio
confirmativo para coliformes totales, el más generalizado es el caldo de bilis
lactosa verde brillante (BLVB)
PRUEBA PRESUNTIVA
Todas
las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia.
1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces
para lograr una distribución uniforme de los microorganismos.
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril
tomar una alícuota de 1 mL de la muestra original y llevarlo a uno de los tubos
conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril, obteniendo de esta manera una
dilución de 10-1 .
4. Agitar el tubo de la dilución 10-1 y con otra pipeta
estéril tomar una alícuota de 1 mL y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de
dilución estéril para obtener una dilución de 10-2.
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución
de 10-3 o hasta donde sea necesario.
6. Inocular asépticamente con 1 mL de muestra por
triplicado, tubos de fermentación conteniendo caldo lactosado o caldo lauril
triptosa, a partir de las últimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores
en refrigeración por si se requiere su utilización posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C
durante 24horas.
8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera
lectura para observar si hay tubos positivos, es decir, con producción de
ácido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y producción de gas en
el interior.
9. Al hacer esta verificación es importante asegurarse
que la producción de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa, en
cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con
burbujas de aire.
10..Para evitar este tipo de confusiones es recomendable
revisar las campanas Durham antes de proceder a la inoculación y desechar
aquellos tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire ó de alguna manera
eliminar éstas y así poder utilizarlos.
12.En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de
los tubos, continuarán en incubación 24 horas más. 13.Después de 48 horas (±
2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni
producción de gas, los tubos se toman como negativos.
INTERPRETACIÓN:
· Si el total de tubos son NEGATIVOS:
El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y
FECALES en la muestra analizada.
· Todos
aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán
convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para
Coliformes Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado
positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con
tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C. 3. Después de
la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIÓN:
· Si se
observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo
anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del
NMP.
· Si en
ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez:
Se consideran NEGATIVOS, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del
cálculo del NMP
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas
confirmativas para Coliformes
Totales y Fecales, establecer los códigos correspondientes
para calcular por
referencia en las tablas estadísticas el NMP de
Coliformes Totales y
Fecales en 100 mL de agua.
ELABORACIÓN Y PRESENTACIÓN DE RESULTADOS.
Los resultados se elaboran de la siguiente manera:
- Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final
con valor cero.
- A continuación se establece el triplete de valores
correspondiente a las tres series anteriores a la del valor cero que
podrá ser leída en la tabla del NMP.
- Para efectos de expresar el valor obtenido basándose en 100 mL de
muestra habrá de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real
de muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete
escogido.
En general se tiene:
NMP/C: NMP leído
en la tabla/Volumen real de muestra inoculada en cada tubo (mL)
BIBLIOGRAFIA
1.- Swanson K.M.,
Petran R.L., Hanlin
J.H. (2001) “Culture Methods
for
Enumeration of
Microorganisms”. In:
Compendium of Methods
for the
Microbiological Examination of Foods.
4thed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 53-67.
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